1. 细胞株的复苏

a. 将冻存管在37℃水浴锅中迅速完全融化(保持冻存管的盖子在液面以上以防止污染)，并适当轻轻摇晃促融，切勿vortex。快速、完全融化可以提高细胞的复苏效果。
b. 打开冻存管前时用70%酒精擦拭细胞冻存管外壁，注意某些记号笔不耐酒精，小心标注的记号被擦拭掉。
c. 将完全融化的细胞直接离心，或者转移至无菌1.5ml或其它合适无菌离心管中，500g离心2-5min，吸除上清，注意不要吸走细胞沉淀，然后用新鲜完全培养液重悬后转移至培养器皿，混匀，置于CO₂培养箱37℃培养。
d. 第二天视贴壁或生长状态，更换培养液。
2. 贴壁细胞的常规传代流程
a. 将冷藏的细胞培养液、PBS等放入37℃水浴锅内预热。
b. 以10cm细胞培养皿为例。吸出原培养皿中的培养液，用2-5ml无菌PBS润洗细胞1-2次以去除残留的血清(如果细胞贴壁较差，润洗时要轻柔以避免细胞飘起)，然后加1-2ml胰酶细胞消化液(含EDTA)室温消化，注意消化时间，通常为1-5分钟。如果细胞比较难消化，可以置于37℃细胞培养箱一定时间以加速消化。注意：消化时间过长，会导致传代后细胞出现生长状态不良的情况。
c. 每30秒-1分钟用显微镜观察细胞消化情况，贴壁细胞明显收缩、细胞间间隙变大、细胞趋于圆形但还未漂起，并用移液器吹打细胞发现细胞刚好可以被吹打下来时，吸除胰酶细胞消化液，再加入1-2ml新鲜完全培养液，适当晃动细胞皿以终止胰酶作用，用移液器轻轻吹打贴壁的细胞，获取细胞悬液。吹打时需控制力度，避免产生大量气泡，将细胞悬液分别接种到另外的2~5个细胞培养皿内，加入新鲜培养液，置于CO₂培养箱37℃培养，第2天观察细胞贴壁生长情况。
d. 也可以在消化后，加3-5ml完全培养液终止消化，用移液器轻轻吹打细胞悬液，尽量把细胞全部吹落、吹散，然后将全部细胞悬液500g离心2-5min，离心后去上清，再用完全培养液重悬后转移到新的培养皿中，添加适量完全培养液，于CO₂培养箱37℃培养。
e. 注意培养液的酚红颜色变化或根据细胞的换液要求定期换液，待细胞密度达到80-90%时需要传代或者冻存。如果没有及时传代导致细胞过密，传代后细胞容易出现生长状态不良的情况。
3. 悬浮细胞的常规传代流程
a. 将细胞悬液转移到无菌离心管内，500g离心2-5min，弃去上清，加入新鲜的培养液，用吸管小心吹散沉淀，获取细胞悬液，将细胞悬液分别接种到另外的2-5个细胞瓶内，加入新鲜完全培养液，置于CO₂培养箱37℃培养。
b. 也可以取少量悬浮细胞直接转移到新的培养瓶中，添加适当的新鲜完全培养液，置于CO₂培养箱37℃培养。
c. 注意培养液的酚红颜色变化或根据细胞的换液要求定期换液，待细胞密度达到80-90%时可以考虑传代或者冻存。
4. 半贴壁半悬浮细胞的培养（以T25瓶为例）
a. 培养液（含悬浮的细胞）：用移液器吸出培养液转移到无菌离心管中；

b. 贴壁部分：用1ml PBS洗细胞，吸出PBS放入到第1步装有培养液的离心管中收集（不要直接丢弃，里面有细胞）；
c. 培养瓶加入胰酶1ml，放入培养箱静置消化；
d. 消化时间跟据细胞特性有所不同，显微镜下看到细胞明显收缩变圆，侧立培养瓶细胞可以滑落时可终止消化，全程不要拍打培养瓶；
e. 用3ml含血清的培养基终止消化，将消化下来的细胞悬液吹散细胞后收集到第1步的离心管；
f. 将离心管在1200 rpm（约250g）3min离心，离心完毕弃掉上清，加入新的培养基重悬，按实际情况分瓶，放入培养箱培养。
5. 细胞株的冻存
a. 按照细胞传代方法收集细胞。
b. 细胞计数：一般要求冻存的细胞，每毫升的细胞数量为1×10⁶-10⁷个细胞。
c. 取适当细胞悬液，500g离心2-5min，弃上清，加入细胞冻存液，重悬，转移到冻存管中，用记号笔标记好细胞株名称、冻存日期、代数等信息，并记录在相应表格中以便管理和快速查找细胞位置。
d. 将冻存管放入专用的细胞冻存盒中，-80℃过夜，然后转移至液氮灌中保存。如果没有专用的细胞冻存盒，可以按下面程序进行冻存：4℃ 1h，-20℃ 2h，-80℃过夜，然后转移至液氮灌中保存。冻存细胞储存在-80℃中通常不建议超过半年，时间太长会影响复苏效率。推荐使用来尔文的程序性细胞冻存盒。
e. 为保持细胞的良好状态，每隔1年，取出1-2支冻存的细胞复苏一次，并冻存新的细胞。 
6. 温馨提示：
a. 每丢弃一个液体前都要想一下里面有没有可能有细胞，避免丢失细胞。
b. 细胞种类、细胞密度、细胞状态、甚至胰酶的品牌，均影响到细胞的消化时间，所以消化的时候不要只看时间，以显微镜下细胞的状态来确定消化终点，部分难消化的细胞消化时间甚至可以长达15分钟。
c. 细胞的传代比例通常说的是等体积的容器，不同容器需要换算；例如：一个T25培养瓶的细胞传到一个10cm培养皿里面，虽然是1传1，但是比例可不是1:1；T25瓶底面积25cm2，10cm培养皿底面积约为55cm²（10cm的培养皿指的是培养皿的外径，而培养皿的内径约为8.4cm，故根据内径可求出其底面积为55cm²），所以实际传代比例为1:2.2。
d. 在有关离心机的实验中，标准的离心条件应该是用RCF(relative centnifugal fieldt)来衡量，而在实际大家实验过程中，往往习惯用rmp即每分钟转速来表示；RCF即表示相对离心场，以重力加速度g(980.66cm/s2)的倍数来表示；RCF=1.119×10-5×(rpm)2×r（其中r表示离心机转轴中心与离心管中心的距离，单位为cm）；所以每个实验室离心机转速设置是不一样的，常规建议1200rpm 大约250g。