细胞转染表达目的基因是实验室的一项基础技术，但导致实验失败的原因却有很多。目前针对基因表达的载体一般分为病毒和非病毒载体，病毒载体由于其高转导效率、易筛选稳定细胞株、大规模的生产能力使其成为理想的基因表达载体。其中腺相关病毒（Adeno-associ ated virus, AAV）载体、慢病毒（Lentivirus）载体和腺病毒载体（Adenovirus）是最常用的病毒载体。目前，慢病毒是产业应用相对成熟的病毒载体类型，尤其是在免疫细胞治疗，肿瘤研究领域起到了关键性的作用。

随着科研人员对慢病毒的广泛使用，越来越多的操作难题也显露了出来，下面给大家整理一些慢病毒操作中的常见问题及解答：

Q1：用于慢病毒感染的细胞接种量多少才合适呢？

A：以在感染3天左右长满培养皿底部为宜，不同细胞根据其生长速度灵活调整接种量

Q2：慢病毒感染后细胞状态异常？

A：出现这种情况时，有几个主要原因：

1）首先，确定是否有支原体或者细菌污染

2）可能是MOI（感染复数）过高，需要摸索寻找最适合的MOI

3）同时考虑目的细胞可能比较敏感，更换其它细胞感染确定病毒是否有问题

4）如果以上都排除后细胞状态仍然不好，尝试增加血清含量，观察细胞状态是否好转

Q3：慢病毒感染效率低怎么办，如何提高慢病毒感染效率？

A：慢毒感染效率低，主要需要考虑的问题有：

1）细胞是否适合用慢病毒进行感染？（慢病毒适用于大部分细胞系，例如肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞等，但也有一些细胞不适合用慢病毒感染，可能更适合用腺病毒，可查阅文献，或咨询我们）

2）慢病毒是否进行了正确的存储和稀释？如果病毒存储不当或反复冻融会降低病毒活性，从而导致感染效率降低

3）感染操作问题：首先排查MOI是否合适；其次可以使用1/2体积感染法来增加感染效率；最后感染换液（一般24 h）及观察的时间是否合适

4）对于一些难感染细胞的感染方法：例如悬浮细胞可使用平角离心转染法，其他一些较难感染的细胞可进行二次感染

5）可以添加助转染试剂polybrene增加感染效率

Q4：慢病毒感染细胞荧光表达较弱？

A：荧光蛋白的亮度与启动子、表达方式和连接原件等有关：

1）不同启动子诱导荧光蛋白表达的强弱不同，如UBC相对于EF1α、CAG、CMV等强启动子表达较弱

2）融合或非融合表达与荧光强度也有很大关系，融合表达时荧光蛋白可能出现错误折叠等现象，导致检测不到荧光信号或荧光较弱；非融合表达时一般选择连接肽作为连接原件，如2A肽或IRES将ORF分隔开

3）带荧光的慢病毒感染细胞后，荧光的强度取决于病毒进入到细胞的颗粒数、细胞状态、细胞类型、观察时间等因素，荧光表达的强度与目的细胞感染病毒的颗粒数正相关，一般感染细胞后72 h观察荧光强度最佳，而增殖较慢的细胞可以适当延长时间

4）也可能会遇到过表达的慢病毒比对照的荧光要暗的情况，这主要是因为基因的插入，会影响位于下游的荧光蛋白表达

Q5：在筛选稳定细胞株时，为什么细胞荧光正常，药物筛选后大量荧光阳性细胞死亡？

A：出现这种情况时，有几个主要的原因：

1）抗性基因由弱启动子启动表达较弱

2）抗性基因表达在IRES之后

3）使用药物剂量过高

Q6：为什么慢病毒稳定株会出现表达或者干扰效果丢失？

A：慢病毒是RNA病毒，感染细胞后会整合进细胞基因组，因此理论上该基因一直都会表达。 但并不意味着稳定株一直传代是一个好的选择。

    因为一方面，细胞传代次数增加可能使得该细胞干扰或者过表达的基因受到代偿机制的调节，导致多次传代后干扰和过表达效果下降，另外一方面，细胞本身随着传代增加其理化性质会逐渐变化，比如原代细胞随着传代次数增加细胞逐渐老化，基因表达谱变化本身就会很明显，又比如永生化细胞或者肿瘤细胞随着传代次数增加其积累突变也是增加的，这也会导致其表达谱变化。因此建议，稳定株构建好之后可以多冻存代数较早的细胞，每次实验尽量使用代数靠前的细胞。