永生化人胆囊上皮细胞/人胆囊上皮细胞永生化

一、基本信息

种属：人

组织来源：胆囊组织

传代比例：1:2 传代

形态：上皮细胞样，多角形细胞样

生长特征：贴壁生长

二、完全培养基配置

M199培养基500ml + 优质胎牛血清15% + 1%双抗（推荐专用培养基）

三、简介

胆囊，是位于右方肋骨下肝脏后方的梨形囊袋构造，有浓缩和储存胆汁之作用。胆囊壁由粘膜、肌层和外膜三层组成，胆囊内面以粘膜覆盖，有发达的皱襞。胆囊收缩排空时，皱襞高大而分支；胆囊充盈时，皱襞减少变矮。粘膜上皮为单层柱状，内分散分布着少量杯状细胞。胆囊粘膜细胞具有典型的吸收型细胞的特征，具有较强的吸收和浓缩功能，上皮细胞吸收胆汁中的水和无机盐，经细胞侧面的质膜转运至上皮细胞间隙内，吸收的水和无机盐通过基膜进入固有层的血管和淋巴管内。同时，胆囊粘膜亦有分泌功能，分泌粘液。

四、细胞检测

细胞角蛋白 19 (CK-19) 免疫荧光染色为阳性免疫荧光鉴定，细胞纯度可达 90% 以上，不含有 HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

五、培养参数

倍增时间：每周2 - 3次

换液频率：2-3天换液一次

培养条件：气相：空气95%；二氧化碳5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%

冻存条件：冻存液：90% FBS，DMSO 10%，或使用非程序冻存液

六、备注

人胆囊上皮细胞永生化该细胞通过慢病毒转染的方式携带 SV40 基因。

七、产品使用

仅限于科学研究，不可作为动物或人类疾病的治疗产品使用。

八、细胞接收处理流程

观察有无破损漏液情况，如有请拍照及时联系客服。

酒精消毒培养瓶表面后显微镜下观察细胞状态，观察拍照后不用打开培养瓶盖放入培养箱静止 2-3 小时稳定细胞状态。

请按照细胞操作指南进行第一次传代冻存处理。

产品随货会附带细胞说明书、细胞培养操作指南、细胞鉴定、支原体检测报告。

若产品有异常或其他疑问，可随时联系客服；转至技术支持。

九、细胞接收后的处理

收到细胞后，75% 酒精消毒瓶壁将 T25 瓶置于 37℃培养箱放置约 2-4h，若发现培养瓶破损、有液溢出及细胞有污染，请拍照后及时联系我们。

静置完成后，请在 4 或 5X 显微镜下确认细胞状态，同时给刚收到的细胞拍照（10×，20×）各 2-3 张以及培养瓶外观照片一张留存，作为售后时收到时细胞状态的依据。

悬浮细胞：T25瓶置于 37℃培养箱放置约 2-3h，然后抽出瓶中的培养基和细胞1000rpm 离心 5 分钟，弃去上清重悬后接种到新的培养瓶中（加入按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基）。

贴壁细胞：细胞在 37℃培养箱中放置 2-3h，显微镜下观察细胞的生长和贴壁情况，有些贴壁细胞在快递运送过程中会因振动脱落和脱落后成团的情况。若镜下观察细胞的生长密度若在 60% 以下，可去除培养瓶中灌液培养基（若有未贴壁的细胞需要离心回收，重悬打入到原培养瓶中），加入新配制的完全培养基 6-8mL，放到细胞培养箱中继续培养。若细胞生长密度达 70%-80% 以上，可以对细胞进行传代处理。传代过程中，若因运输振动脱落的细胞需要离心回收。

半贴细胞和贴壁不牢（悬浮）细胞：T25 瓶置于 37℃培养箱中约 2-3h，显微镜下观察细胞的情况，若细胞密度在 60% 以下，客户需收集 T25 瓶中的悬浮细胞离心后用完全培养基重悬后打回到原培养瓶中继续培养，若细胞生长 70%-90% 对细胞进行传代，传代时需要收集培养基中悬浮的细胞离心后回收。

备注：运输用的培养基（灌液培养基）不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基来培养细胞。收到细胞后第一次传代建议 T25 培养瓶 1:2 传代。

十、细胞处理操作

1. 复苏细胞

从液氮罐中或 - 80℃冰箱中查找到需要复苏的细胞，水浴锅提前打开预热 37℃。

将含有 1mL 细胞悬液的冻存管在 37℃水浴中迅速摇晃解冻；

加入到含 4-6mL 完全培养基的离心管中混合均匀；

弃去上清液，完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含 6-8ml 完全培养基接种于 T25 培养瓶中（或 6cm 皿中），培养过夜，第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。

2. 细胞传代

如果细胞密度达 80%-90%，即可进行传代培养。

弃去培养上清，用不含钙、镁离子的 PBS 润洗细胞 1-2 次；

加 1-2mL 消化液（0.25% Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于 37℃培养箱中消化 2-3min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后，加 5ml 以上含 10% 血清的完全培养基终止消化；

轻轻吹打细胞，完全脱落后吸出至离心管中，1000rpm 离心 3-5min，弃去上清液，补加 1-2mL 完全培养基后吹匀；

按 5-6mL / 瓶补加完全培养基，将细胞悬液按 1:2 到 1:3 的比例分到新的含 6-8mL 完全培养基的培养皿中或者培养瓶中。（即 1 个 T25 传代接种至 2~3 个 T25 或者 2~3 个直径为 6cm 的培养皿）

3. 细胞冻存

血球计数板计数，来决定细胞的冻存密度。一般细胞的推荐冻存密度为 1×10^6~1×10^7 个活细胞/ml。细胞冻存时按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中。

1000rpm 离心 3-5min，去掉上清。用配制好的细胞冻存液重悬细胞，按每 1ml 冻存液含 1×10^6~1×10^7 个活细胞/ml 分配到一个冻存管中将细胞分配到冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息。

按冻存数量加入无血清冻存液后直接放 - 80℃冰箱过夜，后续可转入液氮罐中长期保存。